Forschungsprojekte der KAKS

Einsatz von CAR-T-Zellen beim Retinoblastom

Einsatz von CAR-T-Zellen beim Retinoblastom

– Dr. med Annette Künkele – Charité, Universitätsmedizin Berlin, Prof. Dr. Ulrich Schraermeyer – Universitätsklinikum Tübingen

Publikation der bisherigen Ergebnisse dieses Projekts: Andersch et al. BMC Cancer (2019) 19:895 (https://doi.org/10.1186/s12885-019-6131-1) publiziert.

Im Jahre 2016 initiierte die KAKS das erste Retinoblastimprojekt mit Immunzellen zur Bekämpfung von Tumoren. Dabei sollen die Tumorzellen über bestimmte Marker auf ihrer Oberfläche erkannt und durch körpereigene Immunzellen zerstört werden. Die Untersuchungen zeigten, dass der Kontakt der Immunzellen (CAR-T-Zellen) mit den Krebszellen dazu führte, dass funktionelle CAR-T-Zellen generiert wurden, die diese Krebszellen spezifisch an den Oberflächenmarkern erkennen konnten, d.h. CD171-spezifische als auch GD2-spezifische CAR-T-Zellen. Durch den gezielten Angriff der CAR-T-Zelle über die Moleküle CD171 oder GD2 auf den Krebsoberfläche wurden die untersuchten Die Krebszellen entledigten sich zwar nach einiger Zeit des einen Oberflächenmarkers, aber ein Wechseln des Markers in sequentiellen Ansätzen führte zu einer effektiven Abtötung aller Retinoblastomzellen.

Die genetisch programierten Immunzellen (CAR-T-Zellen) die Tumorzellen so erfolgreich vernichten, dass als nächster Schritt eine in vivo Studie in Tübingen gestartet wurde. Hierzu werden die CAR-T-Zellen aus Berlin am Universitätsklinikum Tübingen im Mausmodell eingesetzt. Das Mausmodell entstammt dem von der KAKS vor einigen Jahren initierten Projekt “Prevention of radiotherapy induced secondary tumours in retinoblastoma animal models” (siehe unten). Die KAKS hat die beiden Gruppen zusammengebracht, so dass die Forschung jetzt nahtlos und kostengüsntig fortgesetzt werden kann.

Initiert und gefördert von der KAKS und von der Fa. CooperVision

Bekämpfung von Chemoresistenzen

Bekämpfung von Chemoresistenzen

– Universitätsklinik Lübeck – PD Dr. rer. nat. Vinodh Kakkassery

Auch bei der Chemotherapie gegen das Retinoblastom gelingt es den Tumorzellen Resistenzen zu entwickeln. In diesem Forschungsprojekt werden die Sphingolipide als Angriffspunkt für Chemotherapieresistenzen untersucht. In Voruntersuchungen konnte gezeigt werden, dass sich das biologisch aktive Lipid Sphingosin-1-Phosphat vermehrt in chemotherapieresistenten Retinoblastomzellen ansammelt. Es wird nun geprüft inwieweit eine experimentell erzeugte Verminderung von Sphingosin-1-Phosphat eine Krebszelle wieder empfänglich für Chemotherapeutika macht, um diese Erkenntnis dann in einem Tiermodell zu testen.

gefördert von der KAKS und der Deutschen Kinderkrebsstiftung

Rb-Inhibitoren gegen Tumorzellen

Mechanismen der Tumorentstehung

– Universitätsklinikum Essen – Dr. Steenpaß

Publikationen: Schipper L, Kanber D, Steenpass L (2018) Generation of heterozygous
and homozygous hESC H9 sublines carrying inactivating mutations in RB1. Stem
Cell Res. http://doi/10.1016/j.scr.2018.09.016. Epub 2018 Sep 26

Weshalb entsteht das Retinoblastom gerade im Auge und gerade bei Kleinkindern? Bisher ist nicht klar, warum der Tumor bei Kleinkindern nur im Auge entsteht und welche molekularen Mechanismen zur Tumorentstehung beitragen. Klar ist, dass die Allele des Retinoblastom-Gens beim erblichen Retinoblastom in allen Zellen defekt (mutiert) sind oder fehlen und dass jeder Krebs aus einer einzigen Ausgangszelle entsteht. Wodurch wird aber die Entstehung in anderen Zellen verhindert? Auch diese Zellen haben kein funktionierendes RB- Protein (Tumorwächter) mehr, welches in gesunden Zellen ein unkontrolliertes Zellwachstum verhindert.

Um diese und weitere fundamentale Fragen aufzuklären und mehr über die Ausgangszellen des Tumors im Auge herauszufinden, wurde ein Labor-Modell der Augenentwicklung mit Stammzellen entwickelt werden, in dem die Auswirkungen von Mutationen im Retinoblastom-Gen untersucht werden können. Bereits publizierte Ergebnisse anderer Gruppen zeigen, dass der Ursprung des Tumors in Zellen der neuralen Retina lokalisiert zu sein scheint und nicht im retinalen Pigmentepithelium.

In der Forschungsgruppe von Frau Prof. Dr. Steenpaß an der UK Essen fördert die KAKS nun ein Modells für das Retinoblastom mit Hilfe der sog. Organoid-Technologie entwickelt. Diese Technologie ermöglicht Untersuchungen an organartigen Strukturen ohne Tierversuche. Ein Organoid ist eine kleine Struktur, die in einer Zellkultur aus Stammzellen erzeugt wird und weitgehend die Ausprägung von Organen annimmt. Solche Organoide haben dann ähnliche Eigenschaften wie entsprechende Zelltypen im Zellverband wie z.B. Zapfen und Stäbchen. Diese konnten bereits erfolgreich erzeugt werden und wurden mittels Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen. Die Färbungen zeigten, dass sich die Organoide sogar räumlich ausgerichtet wie das menschliche Organ organisieren: Photorezeptoren liegen außen, andere Zellen liegen innen. Zur Generierung der Stammzellen für die Organoid Herstellung wurde das CRISPR/Cas9- System eingesetzt. Bei CRISPR/Cas9 handelt es sich um eine in der Presse mit sehr viel Aufmerksamkeit verfolgte Technologie, mit der Mutationen in ein Genom an ganz bestimmter Stelle eingeführt werden können. Bislang wurden Retina-Organoide mit drei Zelllinien mit Mutationen in RB1 hergestellt. Die generierten Stammzellen weisen eine Mutation im Exon 3 entweder auf einem oder beiden RB1-Allelen. Insgesamt wurden acht heterozygote, zwei compound heterozygote und ein homozygoter Klon hergestellt und durch DNA-, RNA- und Proteinanalyse charakterisiert. Die Pluripotenz dieser Klone wurde qualitativ durch Expressionsanalyse der Pluripotenzmarker OCT4, NANOG und SOX2 mittels Immunfluoreszenzfärbung und quantitativ durch FACS-Analyse der Oberflächenmarker TRA1-60, TRA1-81 und SSEA4 nachgewiesen. Eine effiziente Differenzierung in alle drei Keimblätter wurde in beiden Linien beobachtet. Nach den letzten Ergebnissen sieht es so aus, dass die molekularen Vorgänge in der Entwicklung eines Retinoblastoms tatsächlich in dem Organoid-Modell verfolgt werden können. Für die Organoid-Analyse muss eine neue Mikroskopier-Technik entwickelt werden. Dafür werden zurzeit die optimalen Bedingungen für die Whole-Mount-Fluoreszenzfärbung für die verschiedenen Antikörper entwickelt. Zur Finanzierung hat die KAKS hier erfolgreich eine Förderung der Ernst und Berta Grimmke-Stiftung vermittelt, der auf diesem Wege nochmals ausdrücklich gedankt wird.

gefördert von der KAKS

Liquid Biopsy - Frühdiagnose I

Liquid Biospy – Frühdiagnose I

– Charité Berlin und Universitätsklinikum Essen

Die Forschung zur Früherkennung von Krebs durch Blutanalyse („Liquid Biopsy“) hat in den letzten Jahren enorme Fortschritte gemacht: Experten sprechen von „Revolution“ und „Durchbruch“ in der Krebsfrüherkennung. Die KAKS ist mittendrin mit zwei Tumormarkerprojekten (Berlin und Amsterdam).

Die Blutanalyse ist von der KAKS sehr früh als zentrales Forschungsziel in Angriff genommen worden. Für die Früherkennung von Retinoblastomen und Zweittumoren in Blutproben wurden zunächst drei Ansätze versucht: 1. Frühes Auffinden von Antikörpern im Blut, die der Körper zuvor gegen Krebszellen gebildet hat 2. Identifikation von Krebszelloberflächenmarkern, 3. Auffinden von im Blut zirkulierenden Tumorzellen. Diese Ansätze wurden mit Unterstützung von Bild e.V. Ein Herz für Kinder und der KAKS am Max-Planck-Institut in Potsdam im Team von Peter Seeberger und der UK-Essen im Team von Petra Temming erforscht. Dabei konnten wir nutzbare Krebsmarkerproteine auf der Zelloberfläche der Krebszellen im Reagenzglas identifizieren. Diese Ansätze zeigten aber dann, dass die Antikörper und die zirkulierenden Tumorzellen nicht die erforderliche Empfindlichkeit für einen Nachweis im Patietenblut haben.

Daraufhin wurde das Projekt an der Charité in Berlin auf die neuesten hochempfindlichen “Liquid Biopsy” Technologien zur Analyse von Tumor-DNA im Blut und zusätzlich auf eine Markerproteinanalyse durch einen der erfolgreichsten Markerspezialisten, Dr. Bergmann, ausgeweitet. Wiederum mit Unterstützung von Bild e.V. finanzierten wir hierzu eine Doktorarbeit, die ein standardisiertes Protokoll zur Aufarbeitung von Blutproben zu etablierte, welches sicherstellen sollte, dass gewonnene Proben Anwender-unabhängig sachgemäß verarbeitet werden können und zwar so, dass auch geringe Mengen an Tumor-DNA in der Probe identifiziert werden können.

Des Weiteren wurden mittels Literaturrecherche und der Re-Analyse öffentlich verfügbarer Sequenzierdaten eine Liste von Kandidatengenen und genomischen Veränderungen erstellt, die typisch für die häufigsten Zweittumore sind. Diese Liste in Zusammenhang mit genauen Informationen, welche DNA-Bereiche in welcher Weise bei einer Sequenzierung des Patientenbluts abgedeckt werden müssen, bildet die Grundlage für den auf einer Sequenzierung basierenden Früherkennungstest.

Neben dem Retinoblastom Gen RB1, werden bei diesem Test auch diejenigen Gene berücksichtigt, die am häufigsten bei Zweittumoren verändert sind. Nach der Aufarbeitung des Bluts werden jetzt spezielle Sonden zum Aufspüren der DNA Abschnitte der Krebszellen eingesetzt und mit Hilfe eines sog. Hybrid-Capture Sequenzierungs-Assays gezielt die Kandidatengene auf charakteristische Veränderungen untersucht.

In Parallelansätzen werden die DNA Tests am Blut von Retinoblastompatienten und verschiedenen Zweittumortypen sowie zum Vergleich, an gesunden Menschen, getestet. Zuletzt konnten mit einer vergleichbaren Technik bei 98% der Patienten 8 verschiedene Tumore über das Blut entdeckt werden.

Initiiert von KAKS, gefördert von KAKS und Bild hilft e.V. – Ein Herz für Kinder

Liquid Biopsy - Frühdiagnose II / EU Projekt

EU gefördertes Liquid Biopsy Projekt

Ein weiteres großes Liquid Biopsy Projekt, an dem die KAKS beteiligt ist, ist das von der Europäischen Union mit über 1 Mio. EUR geförderte EU Era-net Transcan Tumormarker Projekt. Auch bei diesem Projekt konnte die KAKS ihre selbstgestellte Aufgabe erfüllen, eine Anschubfinanzierung zu leisten, indem sie einen Teil der Vorarbeiten an der Freien Universität Amsterdam (VumC) finanzierte und zudem Ergebnisse und Material des obigen KAKS-Tumormarker Projektes an der UK-Essen einfließen konnten. Die Gruppe von Prof. Dr. Petra Temming, die einen großen Teil der frühen Markerforschung durchführte, ist ebenfalls an dem EU-Projekt beteiligt. Das EU-geförderte Tumormarker Projekt ist in 2018 angelaufen mit Universitäten aus vier Ländern im Rahmen einer großen Forschungskooperation. Wir sind stolz, dass wir mit Hilfe von Ein Herz für Kinder zu den Vorarbeiten zu diesem bedeutsamen Projekt beitragen konnten und jetzt die Integration der Tumordaten aus den verschiedenen nationalen  Tumorzentren finanzieren.

Ziel des auch vom BMBF geförderten Projektes ist ebenfalls die Entwicklung eines nicht-invasiven Bluttestes zur Früherkennung des Retinoblastoms bzw. Zweittumoren über Exosomen (vgl. zu den Vorarbeiten auch http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2015.09.018). Gleichzeitig wird mit KAKS Unterstützung in den Niederlanden eine systematische und umfassende Retinoblastom-Datenbank/Biobank aufgebaut und Patientendaten der letzten 13 Jahre aufgearbeitet. Ein Schwerpunkt des Projekts liegt auch auf der Verbreitung der Ergebnisse an Fachpublikum und Betroffene über Fachartikel, Vorträge und regelmäßig aktualisierte Informationen. In Amsterdam trafen sich im Rahmen dieses Projekts im letzten Jahr Forscher aus fünfzehn Zentren aus ganz Europa, Nord- und Südamerika und Japan. Sie diskutierten zwei Tage darüber, wie das ehrgeizige Projekt am besten koordiniert werden kann und gründeten zu diesem Zweck IRiSC – International Retinoblastoma and Second Cancer Consortium.

https://www.cell.com/cancer-cell/fulltext/S1535-6108(15)00349-9

https://www.gesundheitsforschung-bmbf.de/de/nirbtest-8466.php

https://www.gesundheitsforschung-bmbf.de/de/era-net-transcan-3413.php

Diagnosewegerkennung

Diagnosewegerkennung

– Universitätsklinikum Essen

Diagnosewegerkennung

Diese Studie ist abgeschlossen. In dieser Studie ging es um die Analyse des
Diagnoseweges bei Kindern mit Retinoblastom zur Verbesserung der
Früherkennung. Die Ergebnisse zeigen, dass die häufigsten Erstsymptome die
Leukokorie und das Schielen sind. Die Erstsymptome werden zum allergrößten
Teil von den Eltern bemerkt. Kinderärzte ordnen diese Symptome aber häufig nicht einer Tumorerkrankung zu. Und dabei sehen Kinder in den ersten Monaten meist nur den Kinderarzt,
nicht jedoch einen Augenarzt. Hier haben wir zu Aufklärung der Kinderärzte
mit umfangreichen Projekten angesetzt, damit diese das Retinoblastom in Zukunft erkennen können.

Details der Studie: Es wurde eine Datenerhebung von 1049 Rb-Patienten
zwischen 1992-2011 in Essen durchgeführt. Als häufigste Symptome ergaben
sich Leukokorie und Strabismus (Schielen) und es sind die Eltern, die diese Symptome meist zuerst erkennen. Die Erhebung zeigt, dass sich der Zeitraum bis zur Diagnose in den letzten 20 Jahren nicht signifikant verändert hat. Unser Ziel ist es, auch dies zu ändern. Erste Indizien für eine
Verkürzung aufgrund unserer Arbeit haben wir bereits.

Status: Abgeschlossen

http://www.KinderAugenKrebsStiftung.de/2014/02/kaks-schliest-erstes-forschun
gsprojekt-ab/
http://www.KinderAugenKrebsStiftung.de/wpcontent/uploads/2014/02/WilmDGKJ201
3pdf

Initiiert und gefördert von KAKS

Ergebnisse der Studie sind HIER nachzulesen:
http://www.KinderAugenKrebsStiftung.de/wpcontent/uploads/2014/02/WilmDGKJ2013pdf.pdf)

Mechanismen der Tumorentstehung

Rb-Inhibitoren gegen Tumorzellen

– Universitätsklinikum Essen – Dr. Temming

Die KAKS fördert bevorzugt Projekte, bei denen bereits für die Behandlung anderer Krankheiten bekannte Stoffe eingesetzt werden. Solche Stoffe sind für gewerbliche Forschung in der Regel uninteressant. Sie sind aber hinsichtlich ihrer Nebenwirkungen längst getestet und sind meist kostengünstig am Markt erhältlich. Eines solches Projekt ist die von der KAKS finanzierte zur Suche nach potentiellen Inhibitoren, die zur Behandlung des Retinoblastoms eingesetzt werden können. Die Suche verlief erfolgreich denn die Inhibitoren gegen den Zellzyklusregulator Polo-Like-Kinase 1 (PLK1) sowie gegen MYCN regulierende Faktoren, wie die Aurora A Kinase und das BET Domänen Protein BRD4, erwiesen sich als äußerst effektiv. Der Einsatz der Inhibitoren führte zu einer Verringerung des Wachstums und zu einer Zunahme des Zelltodes (Apoptose) der Retinoblastomzellen in-vitro. Diese von der KAKS finanzierte Studie bildet nun die Basis für in-vivo Studien, die einen großen Beitrag zur der Entwicklung neuer Therapien für Retinoblastompatienten liefern dürften.

gefördert von der KAKS

PDL1 Antikörper

PDL1 Antikörper Unterstützung der Immunzellen gegen das Retinoblastom

– Universitätsklinikum Essen – PD Dr. rer. nat. Alexander Schramm

Dieses KAKS Projekt soll mit Hilfe eines neuen Hoffnungsträgers, dem Antikörper (PD1/PDL1) Krebszellen daran hindern, ein Selbstmord- oder Stoppsignal bei Abwehrzellen auszulösen. Die KAKS hatte dieses Forschungsfeld identifiziert und ein entsprechendes Forschungsprojekt bei der UKE angeregt. Dort wird nun im Rahmen einer Promotion untersucht,  ob diese vielversprechende Technologie bei Retinoblastom Tumoren wirksam ist.

Initiiert von der KAKS

Spätfolgenstudie

Spätfolgenstudie Universitätsklinikum Essen

– Prof. Bornfeld, Prof. Lohmann

Die KAKS ist an der Förderung dieser DKS Studie beteiligt
Ziel ist die Optimierung der Langzeitbetreuung und Verbesserung der Langzeitprognose und Lebensqualität. Dazu wurden die langfristigen Therapiefolgen der verschiedenen Behandlungsformen bestimmt und in Bezug auf das Zweittumorrisiko auch die individuelle genetische Disposition mit einbezogen. Darüber hinaus wurden die erwachsenen Patienten und Eltern über präventive Maßnahmen informiert. In der ersten Phase wurden Kinder und Jugendliche und in der zweiten Phase erwachsene Patienten (Kollektiv von ca. 570 Probanden).

Status: Die Studien sind abgeschlossen und die Ergebnisse liegen vor. Die Ergebnisse der ersten Phasen wurde zwischenzeitlich publiziert (Temming et al. 2015, Pediatric Blood Cancer)

gefördert von der KAKS und der Deutschen Kinderkrebsstiftung

Prevention of radiotherapy induced secondary tumours

Prevention of radiotherapy induced secondary tumours in retinoblastoma animal models

– Dr. Sylvie Julien, Prof. Dr. Ulrich Schraermeyer, Prof. Dr. H. Peter Rodemann – Universitätsklinikum Tübingen

Abgeschlossen

Publiziert unter https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27694105Initiiert von KAKS und gefördert von der Deutschen Kinderkrebsstiftung

Abstract

Retinoblastoma (Rb) is the most frequent primary intraocular tumour in children and, if left untreated, can cause death. Preclinical animal models that mimic molecular, genetic, and cellular features of cancers are essential for studying cancer and searching for promising diagnosis and treatment modalities. There are several models described for Rb, but none of them fully meet our requirements. The aim of this study was to create a novel xenograft-nude mouse-model with broad application possibilities, which closely resembles the clinical observations of Rb patients and which could be used to investigate the development and spread of the tumour by using scanning laser ophthalmoscopy/optical coherence tomography (SLO/OCT) as well as histology methods. We injected human retinoblastoma Y79 cells intravitreally in both eyes of immune-deficient nude mice. The incidences of retinoblastoma as well as growth velocity were analysed 3, 6, 9 and 12 weeks after cell injection in vivo by SLO/OCT as well as ex vivo by electron microscopy (EM) and hematoxylin/eosin (HE) staining. Moreover, internal organs were histologically screened for potentially occurring metastases. Three weeks post-injection, animals developed a retinoblastoma, and after five weeks tumour growth resulted in swelling of the eyes in individual animals, showing a similar phenotype to that of untreated Rb patients at advanced stages of tumour-development. After 12 weeks, 67.5% of all analysed eyes (29 of 42) contained a retinoblastoma. At early stages of Rb development, the SLO/OCT analysis correlated with the histology results. If the tumours were too large, only histological investigations were feasible. The ultrastructural characteristics of the xenograft-tumours were very similar to those described for patient’s tumours. In one mouse, brain metastases were observed. Our retinoblastoma mouse model closely resembles the human disease. SLO/OCT can be used for the detection of Rb at early stages of development and could be used for monitoring the success of future therapies.

 

 

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