Forschungsprojekte der KAKS

Einsatz von CAR-T-Zellen beim Retinoblastom

– Dr. med Annette Künkele – Charité, Universitätsmedizin Berlin, Prof. Dr. Ulrich Schraermeyer – Universitätsklinikum Tübingen

Publikation der bisherigen Ergebnisse dieses Projekts: Andersch et al. BMC Cancer (2019) 19:895 (https://doi.org/10.1186/s12885-019-6131-1) publiziert.

Im Jahre 2016 initiierte die KAKS das erste Retinoblastimprojekt mit Immunzellen zur Bekämpfung von Tumoren. Dabei sollen die Tumorzellen über bestimmte Marker auf ihrer Oberfläche erkannt und durch körpereigene Immunzellen zerstört werden. Die Untersuchungen zeigten, dass der Kontakt der Immunzellen (CAR-T-Zellen) mit den Krebszellen dazu führte, dass funktionelle CAR-T-Zellen generiert wurden, die diese Krebszellen spezifisch an den Oberflächenmarkern erkennen konnten, d.h. CD171-spezifische als auch GD2-spezifische CAR-T-Zellen. Durch den gezielten Angriff der CAR-T-Zelle über die Moleküle CD171 oder GD2 auf den Krebsoberfläche wurden die untersuchten Die Krebszellen entledigten sich zwar nach einiger Zeit des einen Oberflächenmarkers, aber ein Wechseln des Markers in sequentiellen Ansätzen führte zu einer effektiven Abtötung aller Retinoblastomzellen.

Die genetisch programierten Immunzellen (CAR-T-Zellen) die Tumorzellen so erfolgreich vernichten, dass als nächster Schritt eine in vivo Studie in Tübingen gestartet wurde. Hierzu werden die CAR-T-Zellen aus Berlin am Universitätsklinikum Tübingen im Mausmodell eingesetzt. Das Mausmodell entstammt dem von der KAKS vor einigen Jahren initierten Projekt “Prevention of radiotherapy induced secondary tumours in retinoblastoma animal models” (siehe unten). Die KAKS hat die beiden Gruppen zusammengebracht, so dass die Forschung jetzt nahtlos und kostengüsntig fortgesetzt werden kann.

Initiert und gefördert von der KAKS und von der Fa. CooperVision

Bekämpfung von Chemoresistenzen

– Universitätsklinik Lübeck – PD Dr. rer. nat. Vinodh Kakkassery

Bei diesem Projekt handelt es sich um eine Förderung der Kinderaugenkrebsstiftung, die die Grundlage für die Stellung eines Antrags bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) liefern soll. Das ist eines der Förderziele der KAKS. Ziel des Projekts ist es, für eine neue Vorbehandlung oder Begleitbehandlung zur Vermeidung von Resistenzen vor oder nach einer Chemotherapie einen Schalter für den programmiertem Zelltod (Apoptose) (Sphingosin/Sphingosin-1-Phophat) im Retinoblastom zu untersuchen, wobei die schaltenden Enzyme (Sphingokinasen) schließlich therapeutisch inhibiert werden sollen. Mit dem Antikörper Sonepcizumab gibt es aktuell bereits einen Antikörper, der den Überlebensschalter Sphingosin- 1-Phosphat hemmt und so ein möglicher therapeutischer Kandidat beim Retinoblastom sein könnte. Sicherheitsdaten zur Applikation im Auge beim Erwachsenen existieren bereits aus einer Phase-II AMD Studie. Es besteht die Hoffnung, auf diesem Wege Chemotherapieresistenzen zu überwinden. Geplant ist hierfür, siRNA (silencing RNA) mit Etoposid-resistenten WERI-ETOR-Zellen zu inkubieren, um die Aktivität von Sphingokinase 1 und 2 (Schlüsselenzyme zwischen Sphingosin/ Apoptose und Sphingosin-1-P/Überleben) zu vermindern. Anschließend sollen diese Zellen mit dem Chemotherapeutikum Etoposid behandelt und der Sphingosingehalt sowie die Apoptose-/Nekroserate mit der unbehandelter WERI-ETOR-Zellen verglichen werden. Im Anschluss sollen diese Ergebnisse am Tiermodell dann überprüft werden. Mit den Mitteln der Kinderaugenkrebsstiftung wurden hierfür nun Proteomics-Daten zweier Zellinien (WERI-RB1 und WERI-ETOR) generiert, um vor dem DFG-Antrag die Zellen und ihre Resistenzmechanismen zu charakterisieren. Insgesamt wurden 4000 Proteinprodukte untersucht. Aktuell werden diese Daten ausgewertet, eine Publikation verfasst und auf Basis dieser Daten ein Antrag für die Deutsche Forschungsgemeinschaft vorbereitet, der Anfang kommenden Jahres eingereicht werden soll.

gefördert von der KAKS und der Deutschen Kinderkrebsstiftung

Gen-Analyse von Netzhaut-Organoiden

– Universitätsklinikum Essen – Dr. rer. nat. Deniz Kanber, Prof. Dr. Laura Steenpaß

Publikationen: Schipper L, Kanber D, Steenpass L (2018) Generation of heterozygous
and homozygous hESC H9 sublines carrying inactivating mutations in RB1. Stem
Cell Res. http://doi/10.1016/j.scr.2018.09.016. Epub 2018 Sep 26

Weshalb entsteht das Retinoblastom gerade im Auge und gerade bei Kleinkindern? Bisher ist nicht klar, warum der Tumor bei Kleinkindern nur im Auge entsteht und welche molekularen Mechanismen zur Tumorentstehung beitragen. Klar ist, dass die Allele des Retinoblastom-Gens beim erblichen Retinoblastom in allen Zellen defekt (mutiert) sind oder fehlen und dass jeder Krebs aus einer einzigen Ausgangszelle entsteht. Wodurch wird aber die Entstehung in anderen Zellen verhindert? Auch diese Zellen haben kein funktionierendes RB- Protein (Tumorwächter) mehr, welches in gesunden Zellen ein unkontrolliertes Zellwachstum verhindert.

Forschung an menschlichen Netzhautzellen in ihren Entwicklungsstadien ist allerdings nicht möglich. Daher wurde, um diese und weitere fundamentale Fragen aufzuklären und mehr über die Ausgangszellen des Tumors im Auge herauszufinden, ein Labor-Modell der Augenentwicklung mit Stammzellen entwickelt in dem die Auswirkungen von Mutationen im Retinoblastom-Gen untersucht werden können. Bereits publizierte Ergebnisse anderer Gruppen zeigen, dass der Ursprung des Tumors in Zellen der neuralen Retina lokalisiert zu sein scheint und nicht im retinalen Pigmentepithelium.

Konkret wurde bislang mit Hilfe der Organoid-Technologie ein Netzhautzellmodell für das Retinoblastom entwickelt. Das Modell basiert darauf, dass humane embryonale Stammzellen (hESC) im Labor zur Differenzierung als Organoide gebracht werden. Organoide sind organähnliche Strukturen, die wenige Millimeter groß sind und aus mehreren Zelltypen des eigentlichen Organs bestehen. Die im Projekt generierten Netzhaut-Organoide weisen alle sieben Netzhaut-Zelltypen auf, die in ihrer natürlichen Reihenfolge im Embryo entstehen (Ganglienzellen, Horizontalzellen, Amakrinzellen, Zapfen, Stäbchen, Bipolarzellen und Müllerzellen) und in den bekannten Netzhautschichten, d. h. der anglienzellschicht, der inneren Kernschicht und der äußeren Kernschicht, organisiert sind.

Nach erfolgreicher Herstellung der Organoidstrukturen wurden Stammzellen generiert, die eine Mutation auf einem oder auf beiden Kopien des Retinoblastom RB1-Gens tragen. Daraufhin wurde die Entwicklung der mutierten und nicht mutierten Zellen verglichen. Dabei ließ sich bereits mit einfachen Mitteln sehen, dass die Netzhaut-Organoide und die Retinoblastom-Organoide unterschiedliche Strukturen ausbilden. Die Beobachtung beruht bislang nur auf Färbungen an Gefrierschnitten und einigen gezielten RNA-Analysen. Für die Charakterisierung und für ein besseres Verständnis der Netzhaut- Organoid-Differenzierung im Hinblick auf die konkrete Auswirkung der Retinoblastom Mutation (RB1-Inaktivierung) war im nächsten Schritt eine umfassende genetische Analyse (Gesamt-Transkriptom-Analyse) erforderlich. Die Kinderaugenkrebsstiftung hat diese Analyse gefördert. Mit den daraus gewonnenen Daten lässt sich ein grundlegender Einblick in die Entwicklung und Zusammensetzung verschiedener Retinoblastom Zellpopulationen in RB1-mutierten Organoiden erreichen und zudem Richtwerte für die Probennahme und Analyse für zukünftige Arbeiten generieren

gefördert von der KAKS

EU gefördertes Liquid Biopsy Projekt

Ein weiteres großes Liquid Biopsy Projekt, an dem die KAKS beteiligt ist, ist das von der Europäischen Union mit über 1 Mio. EUR geförderte EU Era-net Transcan Tumormarker Projekt. Auch bei diesem Projekt konnte die KAKS ihre selbstgestellte Aufgabe erfüllen, eine Anschubfinanzierung zu leisten, indem sie einen Teil der Vorarbeiten an der Freien Universität Amsterdam (VumC) finanzierte und zudem Ergebnisse und Material des obigen KAKS-Tumormarker Projektes an der UK-Essen einfließen konnten. Die Gruppe von Prof. Dr. Petra Temming, die einen großen Teil der frühen Markerforschung durchführte, ist ebenfalls an dem EU-Projekt beteiligt. Das EU-geförderte Tumormarker Projekt ist in 2018 angelaufen mit Universitäten aus vier Ländern im Rahmen einer großen Forschungskooperation. Wir sind stolz, dass wir mit Hilfe von Ein Herz für Kinder zu den Vorarbeiten zu diesem bedeutsamen Projekt beitragen konnten und jetzt die Integration der Tumordaten aus den verschiedenen nationalen  Tumorzentren finanzieren.

Ziel des auch vom BMBF geförderten Projektes ist ebenfalls die Entwicklung eines nicht-invasiven Bluttestes zur Früherkennung des Retinoblastoms bzw. Zweittumoren über Exosomen (vgl. zu den Vorarbeiten auch http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2015.09.018). Gleichzeitig wird mit KAKS Unterstützung in den Niederlanden eine systematische und umfassende Retinoblastom-Datenbank/Biobank aufgebaut und Patientendaten der letzten 13 Jahre aufgearbeitet. Ein Schwerpunkt des Projekts liegt auch auf der Verbreitung der Ergebnisse an Fachpublikum und Betroffene über Fachartikel, Vorträge und regelmäßig aktualisierte Informationen. In Amsterdam gründeten im letzten Jahr Forscher aus fünfzehn Zentren aus Europa, Nord- und Südamerika und Japan im Rahmen dieses Projekts das IRiSC – International Retinoblastoma and Second Cancer Consortium. Damit wird es jetzt möglich werden, durch Einbeziehung aller neu diagnostizierten Rb-Fälle und die Verlängerung der medizinischen Betreuung, die Risiken für Zweittumore wesentlich genauer abzuschätzen und eine personalisierte Vorsorge/Screening zu entwickeln. Die internationale Kooperation ist dabei extrem wichtig, weil die Forschung bei seltenen Erkrankung  aufgrund der geringen Datenmenge sehr schwierig ist.

Die KAKS ist an den folgenden zwei spannenden Teilprojekten  beteiligt.

Erbliches Retinoblastom: An dem Teilprojekt Erbliches Retinoblastom  sind neun Zentren aus Europa und den USA mit 115  Familien beteiligt

Mutationsanalyse: Bei dem Projekt Mutationsanalyse hatte sich bereits im Vorfeld  abgezeichnet, dass bei der Beurteilung der Tumorrisiken  die konkrete Art der Mutation relevant ist. Hierzu wurden  jetzt verschiedene Mutationstypen in Gruppen kategorisiert  und die Daten des Auftretens diesen Gruppen zugeordnet  und auch die Tumorwahrscheinlichkeit abhängig von der Mutation  bestimmt.

Die Ergebnisse sollen 2021 veröffentlicht  werden.

Ein weiteres Projekt in diesem Zusammenhang ist das zuvor  auch berichtete NIRBtest Projekt zur Detektion von Rb Erst- und  Zweittumoren mittels eines Bluttests, wie von der KAKS originär  bereits in 2012 mit Hilfe von Bild e.V. initiiert. Die Blutuntersuchung,  für die in der ersten Phase die Proben gesammelt  wurden, basiert zwischenzeitlich auf drei Blutbestandteilen:  Freie Tumor DNA, extrazelluläre Vesikel und Blutplättchen.  Alle diese Elemente des Bluts können Auskunft über einen  Tumor geben und werden zentral gesammelt, aber je nach  Art in Frankreich, Holland oder Deutschland analysiert. Das  Programm läuft seit 2 Jahren, ist seit April 2019 genehmigt,  verzögert sich aber neben Corona aufgrund der extrem strengen  und komplexen Datenschutzbestimmungen.

https://www.cell.com/cancer-cell/fulltext/S1535-6108(15)00349-9

https://www.gesundheitsforschung-bmbf.de/de/nirbtest-8466.php

https://www.gesundheitsforschung-bmbf.de/de/era-net-transcan-3413.php

Diagnosewegerkennung

– Universitätsklinikum Essen

Diagnosewegerkennung

Diese Studie ist abgeschlossen. In dieser Studie ging es um die Analyse des
Diagnoseweges bei Kindern mit Retinoblastom zur Verbesserung der
Früherkennung. Die Ergebnisse zeigen, dass die häufigsten Erstsymptome die
Leukokorie und das Schielen sind. Die Erstsymptome werden zum allergrößten
Teil von den Eltern bemerkt. Kinderärzte ordnen diese Symptome aber häufig nicht einer Tumorerkrankung zu. Und dabei sehen Kinder in den ersten Monaten meist nur den Kinderarzt,
nicht jedoch einen Augenarzt. Hier haben wir zu Aufklärung der Kinderärzte
mit umfangreichen Projekten angesetzt, damit diese das Retinoblastom in Zukunft erkennen können.

Details der Studie: Es wurde eine Datenerhebung von 1049 Rb-Patienten
zwischen 1992-2011 in Essen durchgeführt. Als häufigste Symptome ergaben
sich Leukokorie und Strabismus (Schielen) und es sind die Eltern, die diese Symptome meist zuerst erkennen. Die Erhebung zeigt, dass sich der Zeitraum bis zur Diagnose in den letzten 20 Jahren nicht signifikant verändert hat. Unser Ziel ist es, auch dies zu ändern. Erste Indizien für eine
Verkürzung aufgrund unserer Arbeit haben wir bereits.

Status: Abgeschlossen

http://www.KinderAugenKrebsStiftung.de/2014/02/kaks-schliest-erstes-forschun
gsprojekt-ab/
http://www.KinderAugenKrebsStiftung.de/wpcontent/uploads/2014/02/WilmDGKJ201
3pdf

Initiiert und gefördert von KAKS

Ergebnisse der Studie sind HIER nachzulesen:
http://www.KinderAugenKrebsStiftung.de/wpcontent/uploads/2014/02/WilmDGKJ2013pdf.pdf)

Rb-Inhibitoren gegen Tumorzellen

– Universitätsklinikum Essen – Dr. Temming

Die KAKS fördert bevorzugt Projekte, bei denen bereits für die Behandlung anderer Krankheiten bekannte Stoffe eingesetzt werden. Solche Stoffe sind für gewerbliche Forschung in der Regel uninteressant. Sie sind aber hinsichtlich ihrer Nebenwirkungen längst getestet und sind meist kostengünstig am Markt erhältlich. Eines solches Projekt ist die von der KAKS finanzierte zur Suche nach potentiellen Inhibitoren, die zur Behandlung des Retinoblastoms eingesetzt werden können. Die Suche verlief erfolgreich denn die Inhibitoren gegen den Zellzyklusregulator Polo-Like-Kinase 1 (PLK1) sowie gegen MYCN regulierende Faktoren, wie die Aurora A Kinase und das BET Domänen Protein BRD4, erwiesen sich als äußerst effektiv. Der Einsatz der Inhibitoren führte zu einer Verringerung des Wachstums und zu einer Zunahme des Zelltodes (Apoptose) der Retinoblastomzellen in-vitro. Diese von der KAKS finanzierte Studie bildet nun die Basis für in-vivo Studien, die einen großen Beitrag zur der Entwicklung neuer Therapien für Retinoblastompatienten liefern dürften.

gefördert von der KAKS

Identifizierung von Mechanismen der Entstehung von Retinoblastomen durch die Verwendung von Einzelzell-RNA Sequenzierungen

– PD Dr. Kornelius Kerl – Universitätsklinikum Münster

Um die Aussichten (Prognose) von Kindern mit metastasierten  Retinoblastomen zu verbessern, wird in diesem Projekt  erforscht, warum Retinoblastome entstehen und wie einzelne  Anteile der Retinoblastome die intensive Therapie (z. B. Chemotherapie)  überstehen (Therapieresistenz) und somit später  einen Rückfall der Erkrankung verursachen.  In diesem von der KAKS geförderten Forschungsprojekt  wurden dazu die einzelnen Bausteine von 7 Retinoblastomen  (ca 35.000 Zellen) durch aufwendige Methoden untersucht  (Einzelzelluntersuchungen).  Dabei zeigte sich bislang, dass Retinoblastome aus 14 verschiedenen  Tumorzelltypen und weiteren Zelltypen der  Tumorumgebung (z. B. Immunzellen) bestehen. Durch den  Vergleich der Tumorzellen mit normalen (physiologischen)  Zellen der Retina wurden die Signalwege aufgedeckt, die in  Retinoblastomen aktiviert sind. Diese Erkenntnisse bilden  die Grundlage für innovative, viel zielgerichtetere Therapieansätze.  Für Rhabdoid wurde auf diese Weise sehr beeindruckende Ergebnisse  in Acta Neuropathologica publiziert – siehe Webseite  KinderAugenKrebsStiftung.de . Eine entsprechende Publikation  ist auch für dieses Projekt geplant.

Initiiert von der KAKS

Spätfolgenstudie Universitätsklinikum Essen

– Prof. Bornfeld, Prof. Lohmann

Die KAKS ist an der Förderung dieser DKS Studie beteiligt
Ziel ist die Optimierung der Langzeitbetreuung und Verbesserung der Langzeitprognose und Lebensqualität. Dazu wurden die langfristigen Therapiefolgen der verschiedenen Behandlungsformen bestimmt und in Bezug auf das Zweittumorrisiko auch die individuelle genetische Disposition mit einbezogen. Darüber hinaus wurden die erwachsenen Patienten und Eltern über präventive Maßnahmen informiert. In der ersten Phase wurden Kinder und Jugendliche und in der zweiten Phase erwachsene Patienten (Kollektiv von ca. 570 Probanden).

Status: Die Studien sind abgeschlossen und die Ergebnisse liegen vor. Die Ergebnisse der ersten Phasen wurde zwischenzeitlich publiziert (Temming et al. 2015, Pediatric Blood Cancer)

gefördert von der KAKS und der Deutschen Kinderkrebsstiftung

Abstract

Liquid Biospy – Frühdiagnose

– Charité Berlin und Universitätsklinikum Essen

Die Forschung zur Früherkennung von Krebs durch Blutanalyse („Liquid Biopsy“) hat in den letzten Jahren enorme Fortschritte gemacht: Experten sprechen von „Revolution“ und „Durchbruch“ in der Krebsfrüherkennung. Die KAKS ist mittendrin mit zwei Tumormarkerprojekten (Berlin und Amsterdam).

Die Blutanalyse ist von der KAKS sehr früh als zentrales Forschungsziel in Angriff genommen worden. Für die Früherkennung von Retinoblastomen und Zweittumoren in Blutproben wurden zunächst drei Ansätze versucht: 1. Frühes Auffinden von Antikörpern im Blut, die der Körper zuvor gegen Krebszellen gebildet hat 2. Identifikation von Krebszelloberflächenmarkern, 3. Auffinden von im Blut zirkulierenden Tumorzellen. Diese Ansätze wurden mit Unterstützung von Bild e.V. Ein Herz für Kinder und der KAKS am Max-Planck-Institut in Potsdam im Team von Peter Seeberger und der UK-Essen im Team von Petra Temming erforscht. Dabei konnten wir nutzbare Krebsmarkerproteine auf der Zelloberfläche der Krebszellen im Reagenzglas identifizieren. Diese Ansätze zeigten aber dann, dass die Antikörper und die zirkulierenden Tumorzellen nicht die erforderliche Empfindlichkeit für einen Nachweis im Patietenblut haben.

Daraufhin wurde das Projekt an der Charité in Berlin auf die neuesten hochempfindlichen “Liquid Biopsy” Technologien zur Analyse von Tumor-DNA im Blut und zusätzlich auf eine Markerproteinanalyse durch einen der erfolgreichsten Markerspezialisten, Dr. Bergmann, ausgeweitet. Wiederum mit Unterstützung von Bild e.V. finanzierten wir hierzu eine Doktorarbeit, die ein standardisiertes Protokoll zur Aufarbeitung von Blutproben zu etablierte, welches sicherstellen sollte, dass gewonnene Proben Anwender-unabhängig sachgemäß verarbeitet werden können und zwar so, dass auch geringe Mengen an Tumor-DNA in der Probe identifiziert werden können.

Des Weiteren wurden mittels Literaturrecherche und der Re-Analyse öffentlich verfügbarer Sequenzierdaten eine Liste von Kandidatengenen und genomischen Veränderungen erstellt, die typisch für die häufigsten Zweittumore sind. Diese Liste in Zusammenhang mit genauen Informationen, welche DNA-Bereiche in welcher Weise bei einer Sequenzierung des Patientenbluts abgedeckt werden müssen, bildet die Grundlage für den auf einer Sequenzierung basierenden Früherkennungstest.

Neben dem Retinoblastom Gen RB1, werden bei diesem Test auch diejenigen Gene berücksichtigt, die am häufigsten bei Zweittumoren verändert sind. Nach der Aufarbeitung des Bluts werden jetzt spezielle Sonden zum Aufspüren der DNA Abschnitte der Krebszellen eingesetzt und mit Hilfe eines sog. Hybrid-Capture Sequenzierungs-Assays gezielt die Kandidatengene auf charakteristische Veränderungen untersucht.

In Parallelansätzen werden die DNA Tests am Blut von Retinoblastompatienten und verschiedenen Zweittumortypen sowie zum Vergleich, an gesunden Menschen, getestet. Zuletzt konnten mit einer vergleichbaren Technik bei 98% der Patienten 8 verschiedene Tumore über das Blut entdeckt werden.

Initiiert von KAKS, gefördert von KAKS und Bild hilft e.V. – Ein Herz für Kinder